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cDNA第一链合成试剂盒说明书产品组成产品储存与有效期-20C保存有效期为壹年技术支持杭州新景生物试剂开发有限公司研发部e-mail:电话400-0099-857o产品介绍本试剂盒是一种高效、快速并可以去除基因组DNA污染的反转录系统,操作步骤简单,可在半小时内完成cDNA第一链的合成,非常适合荧光定量PCR及普通RT-PCR实验本试剂盒含有高效去除基因组DNA的gDNase;通过42C3min即可去除gDNA有效避免了总RNA中基因组DNA的干扰本试剂盒所含的高效反转录酶RTEnzyme42℃15min即可完成cDNA第一链的合成本试剂盒还具有与RNA模板高亲合性的特点,能通读GC含量高,二级结构复杂的RNA模板用户需自备的试剂与物品.水浴锅或普通PCR仪.冰浴.RNase-free的PCR管.移液器及RNase-free吸头.一次性手套及防护用品和纸巾.台式小量离心机(可配离心
1.5ml离心管和2ml离心管的转子)注意事项1)以下操作步骤请在冰浴上进行,以避免RNA降解2)对于二级结构非常复杂的RNA模板,推荐将模板RNA在65℃孵育5分钟后迅速转移到冰浴中,再进行cDNA的合成3)RTPrimerMix中含有Oligo-dT和随机引物,如果用户需要单独使用Oligo-dT或者基因特异性引物,请按Oligo-dTPrimer50pmol/20|il;或者反向基因特异性引物5pmol/20可的比例加入引物并将加入引物的体积用RNase-FreeddH2O调整为4|il后替换RTPrimerMixo操作步骤以下操作步骤适用于模板量为50ng・2fig的总RNA,如果总RNA量大于2附请按比例扩大反应体系
1.将模板RNA在冰上解冻;5XgDNABufferRNase-FreeddH2Ov5XRTBufferxPrimerMixv在室温(15・25℃)解冻,解冻后迅速置于冰上使用前将每种溶液涡旋振荡混匀,简短离心以收集残留在管壁的液体
2.按照表1的基因组DNA的去除体系配制混合液,彻底混匀简短离心,并置于42℃孵育3min然后置于冰上放置*RNA的完整性对逆转录非常重要,若RNA模板被降解,将导致cDNA产物减少,或者不能扩增长片段的基因表1gDNA去除反应体系
3.按照表2的反转录反应体系配制混合液*如果一次性要合成多管不同的cDNA可预先按倍数将反转录反应体系中的各个组分加入到一个PCR管中并混匀,然后再按10业管的量分装到gDNA去除反应体系中,以减少实验误差表2反转录反应体系
4.将反转录反应体系中的混合液,加到gDNA去除反应体系的混合液中,充分混匀,简短离心以收集残留在管壁的液体
5.42℃孵育15min
6.95℃孵育3min之后放于冰上,得到的cDNA可用于后续实验,或・20℃低温保存步骤
5、6可在PCR仪上完成若后续实验为实时荧光定量PCRcDNA的加样量不应超过PCR体系终体积的1/10例如503的PCR反应体系,cDNA的加量应不超过5plo如果cDNA用作荧光定量PCR时;未呈现标准的“S”形曲线,可能是cDNA的浓度过高而影响背景荧光的采集,建议将得到的cDNA稀释2-5倍后再进行荧光定量PCR实验cDNA第一链合成试剂盒Cat.No.25次制备100次制备5XgDNABuffer60pl220|ilRNase-FreeddEO
1.5ml
1.5mlX25XRTBuffer11011420pilRTEnzymeMix60pl220glRTPrimerMixHOjil420|il5XgDNABuffer2glTotalRNAn|il50ng-2〃gRNase-FreeddH8-n|il5XRTBuffer4|ilRTEnzymeMixRTPrimerMix48。