碳源及碳氮比

碳源及碳氮比对异养反硝化微生物异养反硝化作用的影响碳源及碳氮比对异养反硝化微生物异养反硝化作用的影响农村生态环境2005212:42—45RuralEco—Environment碳源及碳氮比对异养反硝化微生物异养反硝化作用的影响傅利剑郭丹钊史春龙黄为一南京农业高校生命科学学院微生物学系/农业部农业环境微生物工程重点开放试验室，江苏南京210095摘要:碳源甘油和柠檬酸钠及碳氮比对纯培育的异养反硝化菌HP1Pseudomonosalcaligenes异养反硝化力量影响的试验表明碳源种类对硝酸还原酶活性没有明显影响对氧化亚氮还原酶活性有影响.批式培育方式下最适C/N为8菌株HP1可以采用NO;作为唯一氮源进行反硝化作用，证明HP1至少有2种硝酸还原途径.连续培育方式下温度对菌株HP1异养反硝化作用中间产物的积累有影响，不同C/N时均有NH积累C/N为3时还有N0;的积累.关键词:异养反硝化微生物;反硝化作用；碳源;C/N中图分类号:X172;Q935文献标识码:A文章编号1001—5906200502—0042—04E岱ectofcarbonsourceandC/Nratioonheterotrophicdenitrificationofpureculture.FAOnGUODan一zhao巩建华柯尊伟李季.河北省藁城市蔬菜种植区化肥施用与地下水硝酸盐污染争论[J].农村生态环境2004201:56—59KesserOPKissiBihariZetal.BiologicaldenitrificationinacontinuousflowpilotbioreactorcontainingimmobilizedPseudo一ilPlbasbutanovoracells[J].BioresourceTechnol2003871:75—80BaumannBvanderMeerJRSnozziMetal.Inhibitionofdenitri.ficationactivitybutnotofmRNAinductioninParacoccu^denitrificansbynitriteatasuboptimalpH[J].AntonievanLeeuwenhoek1997723:183—189BaumannBSnozziMZehnderAJBetal.Dynamicsofdenitrifi一cationactivityofParacoccu^denitrifieansincontinuouscultureduringaerobic―anaerobicchanges[J].JBact199617815:4367—4374史春龙.富养分化湖泊底泥中反硝化微生物及其反硝化作用[D].南京:南京农业高校2002:42—43格哈特.一般细菌学方法手册[M].厦门高校生物学系微生物争论室译.厦门厦门高校出版社，1989:625—626李军杨秀山，彭永臻.微生物与水处理[M].北京:化学工业出版社，2002:378—380SamuelsonM.Dissimilatorynitratereductiontonitritenitrousox一ideandammoniumbyPseudomonasputrefaz，iens[J].ApplEnvironMicrobiol1985504:812—815作者简介:傅利剑（1979—），男湖北武汉人硕士生主要从事富养分化湖泊，地下水中硝态氮的生物去除方面的研究.上接第41页SoilEcol1998103:239—251[7FerrisHVenetteRCScowKM.SoiImanagementtoenhancebae-terivoreandfungivorenematodepopulationsandtheirnitrogenmineralisationfunction[J].ApplSoilEcol2004251:19一358]BerkelmansRFerrisHTenutaM.Effectsoflongtermcropmanagementonnematodetrophiclevelsotherthanplantfeedersdisap一pearafterlyearofdisruptivesoiImanagement[J]ApplSoilEcol2003233:2232359]BongersTvanderMeulenHKorthalsG.Inverserelationshipbetweenthenematodematurityindexandplantparasiteindexunderenrichednutrientconditions[J].ApplSoilEcol199762:195—199

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0.3g半胱氨酸在氮气爱护下配制并分装到Hun.gate试管中.凡厌氧培育基，皆按此方法配制.

1.

2.2碳氮比测试培育基批式培育测定以甘油为碳源设定甘油一C与N03--N的比值（摩尔比）分别为3:16:18:110:120:1和50:

1.连续培育测定以柠檬酸钠为碳源，设定柠檬酸钠一C与N03—N的比值（摩尔比）分别为3:120:

1.流加培育基和批式培育基成分相同.NO;为氮源培育液:Giltay培育基中不加天冬酰胺，其他成分相同.试验设计柠檬酸钠是分别菌株HP1所选用的碳源对菌株HP1进行碳源种类试验时甘油处理组是所选碳源中反硝化作用最强的，所以在碳源测试中选用甘油和柠檬酸钠2种碳源.按上述要求配制好培育基后接人活化菌株HP1在25下培育定时取样测定N03—NNO;-NNH4+-N加乙快和不加乙快时的N

0.为测试碳源种类对氧化亚氮还原酶活性的影响，分别设置了加乙快和不加乙快处理组.它的原理是溶解于溶液中的乙烘可抑制氧化亚氮还原酶，使反应产生的中间产物N0积累而不被进一步还原为N对参加反硝化作用的其他酶没有影响.通过比较2种处理N0的产量可以得出氧化亚氮还原酶的活性.C/N试验分别在批式和连？蛭C续培育条件下进行.批式培育选用甘油为碳源而连续培育选用柠檬酸钠为碳源，这是由于用甘油配制Giltay培育基易产生沉淀不利于连续培育的操作.方法恒化器的运行:稀释速率

0.045h反应器置于设定温度下培育.NO;测定采纳Cu.Cd柱还原法N0;测定采纳苯磺酸-盐酸一N-

1.蔡乙二氨比色法NH;测定采纳纳氏试剂比色法J.N0测定采用气相色谱法J生物量的测定:发酵液5mL10000rmin离心lOmin.取沉淀于105下烘至恒重，以未接菌的空白培育基作对比.2结果与争论

2.1碳源对菌株HP1异养反硝化作用的影响碳源对菌株HP1异养反硝化作用的影响见图

1.由图1可知HP1采用柠檬酸钠或甘油为碳源，在检测时间段内均有肯定量的N03-残留，变化范围在

3.

925.08mgL.N02积累量也无明显区别，变化趋势全都.以柠檬酸钠为碳源时N0;平均值为

3.92mgL以甘油为碳源时则为

4.30mgL.2种碳源条件下NH4+的积累呈现明显不同的变化趋势N0浓度的变化也有较大差别.在不加乙快抑制时，柠檬酸钠试验组检测不到N0甘油试验组在12h为

0.为gL随后开头下降，到18h为

0.13mgL.加乙快抑制时2处理组N0浓度在前13h均呈提升趋势;在随后的时间内，柠檬酸钠试验组开头下降，到15h趋于平稳，N0浓度为

14.5mgL.甘油试验组则始终呈提升趋势，到18hN0浓度达24mgL.]5]6]7]812131415161718t/ht/h十加乙快N20;+不加乙快N20;卜镂态氮;一矗一硝态氮;一*一亚硝态氮图1碳源对菌株HP1异养反硝化作用的影响Fig.lEffectofcarbonsourceOndenitrificationofStrain册U一_E越蛭［z一一一？g趟蛭+zz加mO—{}g越蛭1z一n量，越蛭e乙一」月g蛰蛭+}lz柏加mO加mO农村生态环境第21卷上述结果表明碳源种类对硝酸还原酶没有明显影响，但对氧化亚氮还原酶有影响.甘油为碳源时氧化亚氮还原酶活性在试验开头时较低，这表现在不加乙快抑制时有NO被检测出，而以柠檬酸钠甘油为碳源时加乙快处为碳源时无N0的积累.理组17h前NO浓度低于柠檬酸钠为碳源时的浓度至17h后NO浓度持续提升超过了柠檬酸钠为碳源时的浓度.作为异养反硝化菌株HP1的电子供体，甘油比柠檬酸钠的效果好.至于NH;的积累，可能是菌体自溶后释放而来的也可能是还原产生的.在本试验中，由于测试时间短后一种可能性较大.

2.2批式培育时碳氮比对菌株HP1异养反硝化作用的影响异养反硝化作用所需作为电子供体的碳源的计算公式为c0C=

2.86cN03一N+

1.71cNO;—N+cDO1式中，cOC所需有机碳浓度molL;cN03-一N:处理水中硝态氮浓度molL;cN02-一N:处理水中亚硝态氮浓度molL.;cDO:处理水中溶解氧浓度molL.由公式1可推导出在无氧条件下，反硝化作用所需碳与硝态氮和亚硝态氮之和的理论比值为

4.6:1摩尔比.在异养微生物生长代谢过程中，有机碳除作电子供体外，还作为碳源养分物用来合成微生物生长所需物质而被消耗，所以实际需要的有机碳量大于由公式⑴计算出的理论比值

4.6:

1.批式培育条件下碳氮比对菌株HP1异养反硝化作用的影响见图2试验结果符合上述推论.由图2可知C/N为3:1时碳源不足，NO浓度低于其他试验组；当C/N为8:1时N:0浓度在各试验组中最高；当C/N超过8:1时NO浓度反而降低.可见在批式培育时HP1培育的最适C/N为8:

1.但为什么当C/N高于8时NO浓度反而下降呢上述试验证明甘油对菌株HP1的异养反硝化没有明显抑制作用.菌株HP1在N03为氮源的培养液中生长60h后氮的变化状况见表

1.由表1可知HP1可采用N03作为唯一氮源进行异养反硝化作用.当C/N高于8时碳源相对〃过剩〃要消耗部分NOr作为氮源作为电子受体的NO相对减少，因此还原产生的NO量降低.由此可见菌株HP1对硝酸还原至少有2种途径.353025曼2015烂10z5图2C/N对菌株HP1异养反硝化作用的影响Fig.2EffectofC/NondenitrificationofStrainHPl表1菌株HP1在NO;为氮源的培育液中生长60h后氮的变化TablelChangeinnitrogenincultureofStrainllPlwithnitrateasnitrogensourceafter60hoursnigL

2.3连续培育时碳氮比对菌株HP1异养反硝化作用的影响菌株HP1在连续培育中不同碳氮比时的生长状况见表

2.表2菌株HP1在不同碳氮比连续培育中的生长状况Table2EffectofC/NongrowthofStrainHPlincontin-hOBSculture1以十重计.由表2可知连续培育时有大量NH4+生成温度对其含量有明显影响温度低时NH4+浓度高.由于试验设计的温度范围不足以导致氨的挥发，因此温度对NH4+生成的影响不是由氨的挥发引起的当碳氮比较低时3:1培育液中能检测到NO的存在且温度高时N02-浓度高;但在碳氮比为20:1时则检测不到N0;•为何会有大量NH4+的积累？缘由尚不清晰.至于N0;积累的缘由，有2种可第2期傅利剑等:碳源及碳氮比对异养反硝化微生物异养反硝化作用的影响45能:一是随着C/N降低碳源相对不足N0［浓度相对提升可促进异养反硝化作用的进行所以有异养反硝化作用的中间产物积累，Samuelson_l对pseud一olnol1osputrefaciens的试验有类似结果；二是批式培养试验证明当C/N为3:1时碳源成为限制性因素，在连续培育时由于无法获得足够的碳源合成足够的反硝化酶系所以有中间产物积累.在C/N为20:1时状况恰好相反，因而检测不到异养反硝化作用的中间产物N03结语不同的碳源种类是通过影响硝酸还原酶以外的其他酶来影响反硝化作用过程的，试验表明它至少影响了氧化亚氮还原酶的活性.在所选择的碳源中，甘油作为碳源时酶合成启动慢，但到17h后N0浓度超过了柠檬酸钠处理组.C/N对反硝化作用的影响受培育方式温度所用碳源等多种因素的影响，需要通过多因子试验加以进一步验证.反硝化作用是去除地下水中过度NO[的较好方法，但地下水中自然反硝化作用受各种条件的限制，如反硝化微生物的数量，碳源，氧气等，反硝化作用强度低.可将抽提的地下水通过生物反应器，向反应器中直接添加纯培育反硝化微生物和合适的碳源，掌握C/N和溶氧量，最大限度地强化反硝化作用，将N03-还原为N削减中间产物的积累达到显着去除NO;的目的.参考文献

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