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文本内容:
油菜下胚轴暗光培育转化
一、步骤流程.灭菌75%酒精浸泡种子lmin时间不能过长
(2)将浸泡过的种子倒入无菌培育盒中,用无菌水冲洗一遍,加入适量的消毒液HgCI2灭菌15min对污染较重的种子,灭菌时间可延长到20min
(3)消毒后,用无菌水冲洗种子
4.5遍留意HgCI2浓度
0.1%-
0.2%用试验室5%的母液稀释即可,用量依据所灭种子的量打算,要完全浸没种子.播种
(1)用无菌镶子,将灭菌的种子播到M0每皿10-12粒
(2)将培育皿放到无菌培育盒中,暗处理培育5-6天,温度24℃.摇菌播种4天后,用AB培育目标菌株,或者5天后用LB培育目标菌株用无菌三角瓶或者离心管(三角瓶中加25-30ml培育液,离心管中加10・20ml培育液)于28℃180・220rpm摇床中留意摇菌前要挑取单菌落,在抗性平板上接种细菌,28℃下培育一天,假如是目标细菌就会在平板上长许多单菌落,此时用10ul枪头吸取该单菌落,再将枪头在上述培育基中反复吸打几次.外植体的制备与侵染
(1)用无菌镜子和解剖刀切取播种6天后的幼苗的下胚轴,每个长度为
0.
8.lcm在Ml液体培育基中切取效果更佳,切取外植体时尽量一刀垂直切下
(2)测菌的OD值(AB中的
0.3左右较好,一般需要两天,LB中
0.8左右较好,一般16h即可),将培育好的菌株在离心机6000rpm(4000rpm)离心10mino倒掉上清,用与菌液相同体积的DM重悬,再在相同条件下离心弃上清后,再用相同体积的DM重悬,取2ml菌液,用20mlDM稀释(在灭菌的培育基皿中进行)
(3)将切好的外植体放到已经配好浓度的皿中,侵染30min(时间不能长,否则外植体易死亡)隔段时间摇摆一次,
4.5次即可,侵染以每皿150-200个外植体/20ml菌液较合适留意可以先配菌液,等外植体全部切完后,将其一起转到配好的菌液中,此时开头计时
5.转到Ml培育基中,每皿20・25个外植体,暗光24℃放置3天后转到M2中并转到光中培育(24℃昼16h/夜8h到.三周后转到M3中,每2-3周继代一次,直至消失绿芽.转入M4生根,需2-4周
二、试验要点.试验过程中,必需保证无菌操作.每次试验前,将全部有用物品预备充分.制备培育基时,用量精确.菌液浓度要合适5每次装过带菌的物品必需灭菌消毒才能倒掉,包括用过的培育基
三、试验时间支配表
四、培育基成分MS:
4.4g/L300mLMO:MS
0.66gBA
0.75g400mLDM:MS
1.76gSucrose12gAS60uL灭菌后加200mLMl液体:MS
0.88gSucrose6gMannitol
3.6g24-D200uLKT60uLAS30uL灭菌后加400mLMl固体:MS
1.76gAgar
2.4gSucrose12gMannitol
7.2g24-D400uLKT120uLAS60uLSTS:[AgSC32产现用现配,时间过长有沉淀母液硫代硫酸钠
0.1M
1.58g溶于100mLddH20;AgNO
30.1M
1.7g溶于100mLddH20VNa2so3VAgNO3=4l将AgNO溶于硫代硫酸钠中24-D:lmg/mL母液,
0.25g24-D加入少量95%酒精和1M的NaOH溶液定容至250mLKT:
0.03gKT先溶于1MHCL中加水定容至lOOmLoAS:100mmol/L母液,
0.392gAs先溶于少量甲醇中,再加二甲基亚碉,定容至20mLTZ:反式Zeatin玉米素,2mg/mL母液,称
0.04gTZ溶于少量75%酒精中,加水定容至20mLIAA:O.lmg/mLlOOmglAA溶于少量95%乙醇中,再加ddH20定容至100mL抽滤分装,保存于-20℃时间步骤留意事项0-5天萌发24℃暗光0天配制DM、MO、播种预备Ml、DM4-5天摇菌提前1-2天预备菌液6天菌液DM=21:10侵染30min转入Ml中,依据浓度确定侵染时间每2ml菌液加20mlDM暗光培育8・9天转入M2此后都在光下培育29-30天转入M3每2・3周继代一次直到长芽43-54天转入M4等根长长后,就可以转到土中栽培MODMMlM2M3M4BasicMedium1/2MSMSMSMSMSMSSucroseg/L蔗糖
30.
030.
030.
010.0Glucoseg/L葡萄糖
10.0Manitolg/L甘露糖
18.
018.0Xyloseg/L木糖
0.25MESg/L
0.624-Dmg/L
1.
01.0Kinetinmg/L感动素
0.
30.3反式-Zeatinmg/L
2.0IAA
0.1ASuM乙酰丁香酮
100.
0100.030STSTimentinmg/L
300.
0300.0Kanamycinmg/L
25.
025.0Agaroseg/L
6.
06.
06.0BasicAgarg/L
122.5g/LPH灭菌前调至
6.0,灭后pH降低
5.
85.
85.
85.
85.8M0:200mL1/2MS
0.44gBA
0.50gDM:200mLMS
0.88gSucrose30g/L6gAS100uM200uL(灭后加)Ml:400mLMS
1.76gSucrose30g/L12gMannitol18g/L
7.2g24-D
1.0mg/L400uLKT
0.3mg/L400uLAS100uM400uLAgarose
2.4gM2300mLMS
1.32gSucrose30g/L9gMannitol18g/L
5.4gAgarose18g24-D
1.0mg/L300uLKT
0.3mg/L300uLTMT300uLKana50mg/mL150uLSTS45uLM3:400mL300mLMS
1.76g
1.32gGlucose10g/L4g3gXylose
0.25g/L
0.1g
0.075gMES
0.6g/L
0.24g
0.18gAgarose6g/L
2.4g
1.8g反式-Zeatin2mg/L400uL300uLIAA
0.1mg/L40uL30uLTMT300mg/L400uL300uLKan25mg/LlOOuL75uLM4ILMS
4.4gAgarose10gSucrose10g。